干細(xì)胞 作為一種能夠自我更新和分化的細(xì)胞類型，已經(jīng)為世人熟知。自被發(fā)現(xiàn)起，干細(xì)胞就一直是研究熱點(diǎn)。根據(jù)《 2016-2022 年中國(guó)干細(xì)胞醫(yī)療行業(yè)市場(chǎng)現(xiàn)狀與行業(yè)前景調(diào)研分析報(bào)告》，2010 年干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)規(guī)模為 215 億美元，到 2015 年時(shí)已增至 635 億美元。預(yù)測(cè)到 2020 年，干細(xì)胞市場(chǎng)規(guī)模達(dá)到 4000 億美元。

作為在再生醫(yī)學(xué)中使用的干細(xì)胞類型，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）有著巨大的市場(chǎng)價(jià)值空間且不斷被看好。

如今，MSC 是臨床試驗(yàn)中干細(xì)胞類型，也是科學(xué)文獻(xiàn)中研究多的干細(xì)胞類型。

范圍內(nèi)其相關(guān)的臨床試驗(yàn)超過(guò) 900 項(xiàng)，中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心注冊(cè)的 MSC 臨床試驗(yàn)超過(guò) 104 項(xiàng)。這充分說(shuō)明 MSC 治療是世界范圍內(nèi)臨床應(yīng)用研究的熱點(diǎn)，而我國(guó)在這一領(lǐng)域的發(fā)展也勢(shì)頭強(qiáng)勁。

MSC 幾乎存在于我們體內(nèi)的所有組織中，但常見(jiàn)于骨髓、脂肪組織、臍帶組織、臍帶血和胎盤。除了具有多功能性和分化成多種細(xì)胞譜系外，它們還能分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，從而實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)損傷愈合和組織再生。

MSC 非常適合細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用，因?yàn)樗鼈兙哂卸喾N譜系分化潛力。

它們可以在體外或體內(nèi)分化成不同類型的功能細(xì)胞以代替老化或受損細(xì)胞。因?yàn)?MSC 的這些特性，其在 2020 年的治療中也表現(xiàn)出了積極效果，病毒感染誘發(fā)機(jī)體內(nèi)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，炎性細(xì)胞因子增加、外周淋巴細(xì)胞減少、肺部損傷等，MSC 具有免疫調(diào)節(jié)能力和損傷修復(fù)功能，所以具有治療的潛能。目前的初步臨床結(jié)果顯示間充質(zhì)干細(xì)胞移植具有安全性和初步的有效性，能夠?yàn)橹匕Y患者提供新的治療工具。

當(dāng)前，干細(xì)胞療法處在技術(shù)到產(chǎn)品轉(zhuǎn)化的過(guò)度階段。那么如何在體外進(jìn)行細(xì)胞規(guī)?；母咝U(kuò)增，是 MSC 應(yīng)用中的關(guān)鍵。
 

傳統(tǒng)擴(kuò)增 MSC 的主要方式是采用方瓶、細(xì)胞工廠等進(jìn)行 2D 貼壁培養(yǎng)，一個(gè)病人單次需要回輸幾個(gè)億單位的細(xì)胞，那么就需要大量的 2D 培養(yǎng)容器以及操作人員；對(duì)于貼壁類型的細(xì)胞培養(yǎng)，如果想要規(guī)模化生產(chǎn)，微載體是不錯(cuò)的選擇方式，新型的擴(kuò)增 MSC 的方式是使用微載體以及波浪式反應(yīng)器 WAVE，可以高效的進(jìn)行干細(xì)胞的擴(kuò)增，培養(yǎng)過(guò)程如下：

一、實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞：間充質(zhì)干細(xì)胞

培養(yǎng)方式：微載體 Cytodex 1 貼壁培養(yǎng)

培養(yǎng)基：無(wú)血清無(wú)外源蛋白成份明確間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基（由原能細(xì)胞科技集團(tuán)自主開(kāi)發(fā)）

反應(yīng)器：WAVE 25

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.

微載體的預(yù)處理

1.1 微載體處理：Cytodex 1 使用 DPBS 泡發(fā) 3 h。

1.2 使用 DPBS 洗滌 2 次 Cytodex 1，DPBS 浸泡后滅菌（121℃，30 min）。

1.3 Cytodex 1 冷卻沉淀后，棄上清，安全柜內(nèi)無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌 2 次，定容。

2.

WAVE 的操作

2.1 無(wú)菌環(huán)境下拆開(kāi)細(xì)胞袋，安裝無(wú)菌空氣濾器等配件。

2.2 將微載體培養(yǎng)液及細(xì)胞懸浮液依次從細(xì)胞袋輸液管道輸入。

2.3 將細(xì)胞袋固定在 WAVE 反應(yīng)器托盤上，連接空氣泵，設(shè)定溫度 37 ± 0.5 度、泵壓、反應(yīng)器轉(zhuǎn)速度和角度。

3.

MSC 細(xì)胞接種及培養(yǎng)過(guò)程

3.1 按 6000 cells/cm²接種新鮮 MSC 細(xì)胞至微載體培養(yǎng)液中（3 g/L）），孵育 30 min-1 h（間歇式搖勻）或者孵育過(guò)夜，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至細(xì)胞不沉降聚集即可。

3.2 每隔一天從細(xì)胞袋無(wú)菌取樣口用無(wú)菌注射器抽取 5 ml-10 ml 培養(yǎng)液進(jìn)行鏡檢及支原體、內(nèi)毒素等安全性質(zhì)量檢測(cè)。

3.3 培養(yǎng) 4-5 天，細(xì)胞長(zhǎng)滿。

4.

MSC細(xì)胞的收獲

4.1 培養(yǎng) 4-5 天后將細(xì)胞微載體懸浮液從細(xì)胞袋出液管道輸出至細(xì)胞收集瓶。

4.2 棄上清，DPBS 洗滌一遍，加入 Tryple 消化酶，溫和搖勻消化 10 min-15 min。靜置，待微載體沉降后，吸取細(xì)胞懸浮液。DPBS 再洗滌 2 遍，吸取細(xì)胞懸浮液。

4.3 離心 400×g，5 min。收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.

細(xì)胞生長(zhǎng)情況

按0.6 × 10⁴ cells/cm2接種新鮮MSC細(xì)胞至微載體培養(yǎng)液中（3g/L），4-5天后細(xì)胞可以長(zhǎng)滿Cytodex 1，每cm2可以生長(zhǎng)2.5 × 104 MSC，細(xì)胞在Cytodex 1上的生長(zhǎng)照片如下圖1。

圖 1. 微載體培養(yǎng) MSC 生長(zhǎng)圖片

2.

流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSC細(xì)胞表面標(biāo)記物

藥典對(duì) MSC 細(xì)胞表面標(biāo)記物的檢測(cè)要求是：CD73、CD90、CD105 ≥ 95%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR ≤ 2%。對(duì)上述培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示細(xì)胞表面標(biāo)記物均滿足要求并且陽(yáng)性指標(biāo) CD73、CD90、CD105 、CD44 ≥ 98%，陰性指標(biāo) CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR 總和≤ 2%（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖2. 微載體培養(yǎng)MSC流式表型

3.

MSC 成脂和成骨分化

對(duì) MSC 進(jìn)行成脂和成骨誘導(dǎo)分化，油紅 O 染色后顯示成脂效果很好；茜素紅 S 染色顯示成骨效果很好。

圖3. 微載體培養(yǎng)MSC成脂分化

圖4. 微載體培養(yǎng)MSC成骨分化

四、成本分析

以培養(yǎng)單人次回輸細(xì)胞量 3.2×109 cells 為例，對(duì)比新型和傳統(tǒng)擴(kuò)增 MSC 方式的成本分析，主要從培養(yǎng)階段的耗材成本和人員成本角度考慮，其中耗材成本如下圖 5，使用 Cytodex 1 和 WAVE 的培養(yǎng)方式相較于 150 mm Dish 能夠節(jié)約 14%，相較于 Hyper  Flask 能夠節(jié)約 190% 的耗材成本。人員成本角度列于表 1，使用 Cytodex 1 和 WAVE 的培養(yǎng)方式可以減少培養(yǎng)批次，從而降低批次間變異性，同時(shí)擁有合理的人員成本。

圖5.不同培養(yǎng)方式耗材成本分析

表1.不同培養(yǎng)方式人員成本分析及批次數(shù)